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FUNDAMENTOS TEÓRICOS
En el momento de realizar las mediciones
en el citómetro de flujo, las células
pueden estar vivas o fijadas, pero obligadamente en
suspensión celular y en forma de célula
única. Se las obliga a pasar alineadas
una a una frente a un haz láser mediante un
flujo continuo, a modo de una delgada corriente de
la suspensión celular. Cada célula,
a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente
como consecuencia de la excitación láser
a la que es sometida. Los parámetros
que típicamente se miden de forma simultánea
por cada célula son:
- Dispersión frontal de la luz a 2º (forward
scatter), valor proporcional al tamaño
celular.
- Dispersión de la luz ortogonal (side
scatter), proporcional a la cantidad de estructuras
granulares o complejidad de la célula.
- Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes
de onda.
La dispersión de la luz por si sola resulta
ser de bastante utilidad. Comúnmente se
utiliza en la exclusión de las células
muertas, agregados celulares, restos celulares, así
como para reducir el ruido de fondo en la medición
de la fluorescencia. Es suficiente para discriminar
linfocitos de monocitos y granulocitos en muestras
leucocitarias hemolisadas. La dispersión de
la luz también puede utilizarse en la cuantificación
de la agregación de las células vivas.
Convencionalmente, las intensidades de fluorescencia
se miden a diferentes longitudes de onda y de manera
simultánea para cada una de las células.
A fin de medir los componentes de interés de
cada una de las células, pueden ser utilizadas
diversas sondas fluorescentes. Los anticuerpos conjugados
a fluorocromos son utilizados muy a menudo en la cuantificación
de la densidad antigénica de determinados marcadores,
y distinguir subpoblaciones de tipos celulares diferenciados,
incluso aquellas células con expresión
de transgenes.
Mediante técnica de conjugación a
fluorocromos, pueden realizarse mediciones de
la unión de virus u hormonas a sus correspondientes
receptores de superficie. También pueden analizarse
componentes intracelulares mediante sondas fluorescentes
específicas, como por ejemplo el contenido
celular de ADN (permitiendo estudios de ciclo celular
y ploidía), el ADN sintetizado de novo, secuencias
nucleotídicas específicas, ARNm, filamentos
de actina, y en definitiva cualquier estructura para
la que exista un anticuerpo o una sonda fluorescente
disponible. La citometría de flujo puede utilizarse
además en la monitorización de cambios
en el calcio intracelular, del potencial de membrana,
el pH, o en el contenido de ácidos grasos.
Los citómetros de flujo consisten de
complejos sistemas fluídicos, óptica
láser, detectores electrónicos, convertidores
analógico-digitales y digitales, y ordenadores.
Los sistemas ópticos permiten el enfoque láser
en un haz con un diámetro reducido para impactar
sobre el menor número de partículas
posibles simultáneamente. El sistema fluídico
permite un enfoque hidrodinámico del flujo
celular hasta conseguir el alineamiento de las partículas
o células, y en los separadores celulares o
"cell sorters", se produce una rotura
del flujo en gotas de tamaño uniforme para
conseguir la separación de células individuales.
El sistema electrónico se encarga de la cuantificación
de los destellos de fluorescencia y de la luz dispersada
y, bajo el control del ordenador, se consigue la carga
electrónica de las gotas que contienen las
células de interés para poder someterlas
a deflección y recogerlas en tubos específicos
para tal fin, o sobre pocillos de cultivo de tejidos.
El ordenador permite almacenar datos de miles de células
por cada muestra, y representar los resultados gráficamente.
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